Abstract: Метод МСТ впервые применяется к микробным сообществам, выделенным из среды обитания РС МКС. Изучение различных структурно-функциональных особенностей микробных сообществ, формирующихся во внутренних объемах РС МКС, позволяет изучить виды, которые легко адаптируются к условиям среды обитания при воздействии различных космофизических факторов, обнаружить ранее не выявляемые виды биодеструкторов и определить виды микроорганизмов, существующие в выгодном взаимодействии друг с другом. Метод МСТ позволяет оценить функциональное биоразнообразие исследуемых микробных сообществ по потреблению ими разнообразных органических субстратов. Объекты и методы. Для метода МСТ были взяты микробные сообщества, полученные с внутренних объемов РС МКС в различные периоды работы экипажей МКС. Параллельно, с проведением МСТ, осуществлялся метод прямого посева с последующей идентификацией выделенных микроорганизмов с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF на MALDI Biotyper 3.0 в соответствии с протоколами, разработанными компанией «Bruker». Анализируемые штаммы сравнивали с международной базой данных в формате MALDI Biotyper RTC (Realtime Classification). Каждая проба отображала микробное сообщество, отобранное с одной панели или поверхности, изготовленной из различных полимерных и конструкционных материалов. При проведении МСТ применяли стандартные кюветы для иммунологических тестов с 96 ячейками. В каждой отдельной ячейке находился определенный субстрат, набор минеральных солей и трифенилтетразолий бромистый, как индикатор потребления субстрата. При развитии микроорганизмов, способных потреблять тот или иной тест-субстрат, во время инкубации в течение 3-5 суток при 28 градусов, происходило восстановление неокрашенных солей тетразолия до бордово-окрашенного формазана. Регистрация окраски осуществлялась с помощью многоканального фотометра (ридера) «Униплан» при длине волны 510 нм. На основании совокупности полученных данных (спектров потребления субстратов) рассчитывали коэффициенты биоразнообразия (индекс Шеннона, индекс выравненности Пиелу), параметр рангового распределения потребления субстратов (d), а также удельную метаболическую работу микробного сообщества (W). Для сравнения спектров потребляемых субстратов применяли кластерный анализ (кластеризация – по Варду, мера расстояния – Манхеттеновское расстояние). После проведения МСТ проводили посев суспензии микроорганизмов из наиболее яркоокрашенных лунок, содержащих различные группы субстратов. Далее, выделенные из лунок планшетов МСТ микроорганизмы идентифицировали с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF на MALDI Biotyper 3.0. Результаты. В результате по полученным данным методом классического посева были выявлены микроорганизмы, часто встречающиеся в среде обитания РС МКС, такие, как Staphylococcus epidermidis, Bacillus licheniformis, Staphylococcus hominis, Staphylococcus saprophyticus и Micrococcus luteus и др. При проведении микробиологического посева на различные обедненные питательные среды образцов, наиболее активно потребляющих различные виды субстратов (из лунок планшетов для проведения метода МСТ), впервые были идентифицированы такие виды, как Acinetobacter johnsonii и Sphingomonas paucimobilis - грамотрицательные микроорганизмы, которые не были обнаружены ранее классическим методом посева на питательные среды этих же проб. Представители рода Acinetobacter входят в число наиболее актуальных возбудителей оппортунистических инфекций. Эти микроорганизмы обладают природной устойчивостью и приобретенной резистентностью к стресс-факторам и, опосредованно, могут представлять угрозу для здоровья экипажа. В результате продолжающейся работы с выделением микроорганизмов с помощью метода МСТ стало возможным выделить культуры, которые также находятся в среде обитания в не культивируемой форме или покоящемся состоянии. По результатам проведения МСТ после фотометрического измерения значений по всем субстратам, был получен массив данных, представляющий собой СПС (спектр потребления субстратов). В результате были получены данные по 8 микробным сообществам. На основании СПС вычисляли коэффициенты функционального разнообразия исследуемых микробных сообществ. В результате выявлены различия по функциональному биоразнообразию, а также по удельной метаболической работе микробного сообщества и коэффициенту рангового распределения субстратов, как меры устойчивости микробного сообщества. Наиболее стабильными, показали себя 4 сообщества из 8. Одно, наиболее устойчивое стабильное (d=0,325) и три – стабильные с истощенными ресурсами или находящимися под воздействием различного нарушающего фактора (0,416<d<0,737). 4 сообщества характеризовались как дестабилизированные (1,116<d<1,638). Наиболее разнообразными по числу потребленных субстратов были 5 сообществ (N max=32). Обедненными сообществами можно назвать оставшиеся три (N min=5). Наиболее устойчивым и разнообразным являлись два сообщества (d=0,416 и N=31 и d=0,325 и N=32), наименее устойчивым и скудным по разнообразию было одно сообщество (d=1,315 и N=5). Также встречались микробные сообщества, которые показали достаточно высокое биоразнообразие при коэффициенте d, соответствующему дестабилизированному сообществу (d=1,307 и N=26 и d=1,116 и N=21), и, наоборот, низкое биоразнообразие в двух относительно устойчивых сообществах (d=0,558 и N=7 и d=0,737 и N=5). В сравнении с контрольными образцами, где количество потребляемых субстратов варьировало в пределах от 3 до 6, в образцах с микробными сообществами с борта МКС, по количеству потребленных субстратов, наиболее активным были сообщества с 37 и 43 субстратами. Таким образом, применение метода МСТ, основанного на анализе спектров потребления субстратов (СПС), позволяет обнаруживать ранее не выявляемые виды микроорганизмов, определять их сродство к субстратам и, опосредовано, предотвращать или контролировать процессы биодеструкции, купировать технические и медицинские риски в период космического полета. Это приобретает актуальность не только для орбитальных космических станций, но и для баз на других объектах Солнечной системы.

Cite: Дымова А.А. , Горленко М.В. , Костина Н.В. , Шеф К.А. , Родимин В.Д. , Поддубко С.В.
ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА МУЛЬТИСУБСТРАТНОГО ТЕСТИРОВАНИЯ ДЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКИ МИКРОБНЫХ СООБЩЕСТВ СРЕДЫ ОБИТАНИЯ РС МКС
II Российский конгресс по медицинской микробиологии и инфектологии 29 февр. - 1 мар. 2024